绝大多数致病遗传变异由碱基点突变、插入或缺失突变引起，因此，如何在活细胞内修复这些突变以恢复细胞的正常功能，一直是生命科学研究的一个重要目标。近年来，一种新型基因编辑工具——引导编辑（Prime Editing, PE）开始崭露头角，其独特之处在于无需双链断裂及供体模板，展现出纠正致病突变和插入保护性等位基因的巨大潜力。

初代引导编辑工具的效率则相对较低，因此，尊龙凯时的David Liu团队对pegRNAs进行系统性改造，取得了显著成效。在其最新研究中，通过优化双AAV载体系统，成功实现了在小鼠脑、肝、心等多个器官中的高效Prime编辑，为基因治疗提供了新的技术手段。

v3emPE-AAV双载体系统的设计

v3emPE引导编辑系统是由向导RNA（epegRNAs）引导，结合逆转录酶MMLV与nCas9构成的融合蛋白，能够精准编辑目标位点的碱基（包括替换、插入和删除）。该系统主要包括三个成分：epegRNAs、逆转录酶MMLV与nCas9。不过，MMLV与nCas9的编码序列长度（约63kb）超过了AAV载体的包装限制（47kb）。为了解决这一问题，尊龙凯时团队将v3emPE与分裂型内含肽（intein）结合，设计为双AAV载体系统：将PE编码序列在nCas9的第1024位氨基酸处拆分，与来自念珠藻的NpuDnaB快速剪接内含肽的N端和C端分别融合，构建在两个AAV载体上。通过共同转染两个AAV，内含肽能够通过自剪切作用重新组装成完整的PE蛋白，从而恢复编辑功能。

v3emPE-AAV双载体系统的改进

在v3emPE-AAV双载体系统的设计中，进行了一系列关键改进：

• **启动子升级**：用强启动子Cbh替代传统EFS启动子，显著提高了PE蛋白的表达水平。
• **epegRNA稳定化**：通过在传统pegRNA的3'端添加tevopreQ1修饰及8nt linker，显著优化了pegRNA的稳定性、编辑效率和特异性。这些改进使得编辑效率提高了15至40倍。
• **编辑策略**：使用高保真度的引导RNA（epegRNA）和单导向nicking sgRNA（sgRNA），以指导PE精确定位到目标DNA位点（sgRNA设计距离编辑位点40-90nt）。

v3emPE-AAV双载体系统的应用

PCSK9 Q152H被认为是“天然保护突变”，通过降低LDL-C水平显著减少冠状动脉疾病风险，而同时无明显不良反应，可视为一种“有益突变”。文献显示，利用v3emPE-AAV双载体系统已成功在成年小鼠的肝脏中实现了31%和38%的精准编辑；与未处理小鼠相比，经编辑小鼠的总血浆胆固醇水平降低了20%，血浆低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平则下降了27%。这些结果证实了优化后的v3emPE3-AAV系统可以在体内实现强大且与治疗相关的原位编辑，成功在相关组织中植入基因组突变。

v3emPE3-AAV系统的生物安全性

对于v3emPE3-AAV系统的生物安全性，相关研究结果如下：

• **脱靶效应**：通过CIRCLE-seq技术评估了10个潜在脱靶位点，未检测到显著的脱靶编辑，验证了Prime编辑的高特异性。
• **毒性评估**：血清转氨酶（ALT、AST）的水平及肝组织的病理切片均未显示出明显异常，表明v3emPE-AAV系统没有明显的肝毒性。

作为新一代精确基因编辑方法，Prime Editor显示出其独特的创新性。尊龙凯时可以根据客户的需求，设计个性化的epegRNA和nicking sgRNA，以实现目标基因的精准编辑。如果您对此感兴趣，欢迎联系我们咨询！